分子氢与氧化应激损伤———从惰性气体到医疗用气体

气体分子具有重要的医疗价值，临床上吸入氧气用于治疗低氧血症及危重患者，二氧化碳用于多种皮肤病及肛肠疾病的治疗，一氧化氮用于新生儿肺动脉高压的治疗;近年研究显示，一氧化碳可用于治疗肺动脉高压、自发性高血压及器官移植，硫化氢治疗肺动脉高压、高血压、动脉粥样硬化及心肌缺血损伤等，气体分子医学受到了基础研究和临床应用的高度关注。

氢是自然界中含量最多的元素，氢元素占宇宙物质组成的75%左右。过去大部分生物学家一直认为氢气属于生理性惰性气体，2007年，自然医学杂志首次报道了氢气可以选择性地清除细胞毒性的氧自由基，是具有治疗价值的抗氧化剂，此后，学术界对分子氢的作用机制和实验治疗进行了大量研究，揭示了氢气具有广泛的临床应用前景。

1　氢气的生物学特点

氢气是一种无色、无嗅、无味、具有一定还原性的气体，在空气中的含量极少，氢气分子量小且呈电中性，扩散能力很强，能轻易地穿过细胞质膜及各种细胞器膜。

生理状态下，动物和人体内可以产生氢气。食物中未被小肠完全吸收的碳氢化合物到达结肠后，在肠道厌氧菌的作用下发酵，产生氢气、二氧化碳及短链脂肪酸。反应过程是蔗糖+5H2O＝醋酸+4二氧化碳＋8H2；蔗糖＋5H2O＝丁酸＋二氧化碳+4氢气。催化此反应的氢化酶受pH值的影响，pH值为5.5－5.7时，氢气的生成率最高。产生的氢气很大一部分被吸收入血，随血液到达肺脏后可在呼出气Olson等用50μm的微电极探针测定了正常小鼠胃黏膜的氢气浓度为43mmol/L(17－93mmol/L)。Maier等用改良的克拉克型微电极测定了正常小鼠肝中平均氢气浓度为53mmol/L，小肠中氢气浓度范围为118－239mmol/L，脾脏中平均氢气浓度为43mmol/L。有关细胞氧化损伤的研究表明，只要培养基内氢气浓度达到25mmol/L，就可显示出明显的抗氧化作用，这说明在正常小鼠胃、小肠、肝脏、脾脏等腹腔器官内，机体内产生的氢已经明显超过抗氧化所需要的水平。肠源性氢气的生理和病理生理意义目前尚不清楚。

2　氢的选择性抗氧化作用

自由基是指带有未成对电子的原子、分子或离子，自由基是人体正常的代谢产物，生理情况下，体内自由基处于不断产生与不断清除的动态平衡中，自由基过多、过少均会给机体造成不利影响。人体内的自由基95%以上属于氧自由基，包括O2·-(超氧阴离子自由基)、过氧化氢、·OH(羟基自由基)等，这些物质具有比分子氧活泼的化学反应性，统称为活性氧(reactive oxygen species，ROS)。线粒体呼吸链是ROS的主要来源，在线粒体呼吸过程中，电子传递链中途漏出少量电子可以直接单价还原氧气形成O2·-，后者在超氧化物歧化酶的催化下转化为过氧化氢。过氧化氢可以在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下生成水而解毒，剩余的O2·-可以使Fe3+和Cu2+还原为Fe2+和Cu+，后两者与过氧化氢通过Fenton反应生成·OH，而目前机体内未发现能特异清除·OH的生物酶。在这些ROS中，O2·-和过氧化氢毒性作用很弱，并且在生理浓度下具有重要的功能意义，如调控许多信号转导通路，调节细胞增殖、分化及凋亡等生物学行为。生理状态下体内几乎不存在·OH，在缺血缺氧或炎症时，体内会大量产生各类ROS，其中·OH是氧化性最强的ROS，可以非选择性地与核酸、脂质及蛋白质反应，是导致细胞氧化损伤的主要介质。以前氧化损伤治疗的研究思路是寻找足够强的还原性物质，然而，还原性过强会干扰O2·-和过氧化氢的正常生理功能，因此，选择性中和·OH的物质抗氧化损伤可能具有更重要的临床意义。

Ohsawa等通过给予培养细胞线粒体呼吸复合物Ⅰ抑制剂(抗霉素A)来诱导ROS的产生。荧光探针结果显示，胞内氧气和过氧化氢水平升高，而胞质和胞核内的·OH水升亦升高。将氢气溶于培养基后，胞内氧气和过氧化氢水平并未降低，而胞质和胞核内的·OH水平明显下降。同时，研究结果显示，在氧化损伤后，线粒体发生去极化，ATP合成减少，脂质过氧化，DNA碎裂，细胞坏死、凋亡。将氢气溶解于培养基中，能够呈浓度依赖性地抑制上述损伤的发生，增强细胞活力，这表明氢气主要通过选择性中和线粒体中毒性最强的·OH来发挥抗氧化作用，而并不影响具有重要生理功能的ROS，且抗氧化能力呈浓度依赖性。该小组还研究了氢气与大脑缺血再灌注损伤的关系，给大鼠阻断大脑中动脉的血供90分钟，再灌注30分钟，在整个120分钟内给大鼠持续吸入1%～4%(体积分数)的氢气，24小时后，与对照组比较，吸入氢气大鼠的脑梗死面积呈氢气依赖性的降低，以2%～4%氢气的效果最佳；同时，研究还发现氢气在再灌注期吸入有效，而如果只在缺血期吸入则效果不明显；1周后，吸入氢气大鼠的脑梗死面积与对照组的差别更为明显，神经学评分也明显降低，说明氢气不仅抑制缺血再灌注的早期损伤，同时也能抑制其进展性损伤。

3　氢气与氧化性损伤

3.1　氢气与缺血再灌注损伤

当组织细胞缺血、缺氧时，ROS清除系统功能降低，生成系统活性增强，一旦恢复组织血液供应和氧供，ROS便会大量产生与急剧“堆积”，引起强烈的细胞氧化，形成氧化应激。Hayashida等的研究发现，氢气在心肌缺血再灌注损伤中具有显著的保护作用。离体灌流大鼠心脏实验发现，动物预先吸入氢气有利于心脏左心室功能的恢复;整体动物实验发现，氢气可以减少缺血再灌注后心肌梗死的面积，但不改变血流动力学参数，并且可以减轻缺血再灌注损伤后病理性的左心室重塑，研究还发现吸入2%的氢气能提供最显著的保护作用。Nakao等研究了吸入氢气和/或一氧化碳对心肌冷缺血再灌注损伤的作用，对冷缺血6或18小时的大鼠实施同基因异位心脏移植，受体和供体均于再灌注前1小时开始单独吸入氢气(1%～3%)或一氧化碳(0.05‰～0.25‰)或两者共吸入2小时。结果显示，对于6小时的冷缺血，单独吸入氢气(>2%)或一氧化碳(0.25‰)可以减轻心肌损伤。吸入氢气能明显降低血清丙二醛(MDA，脂质过氧化终产物)和高迁移率族蛋白1(HMGB1)水平，而一氧化碳能明显抑制促炎介质的mRNA上调。冷缺血长达18小时可导致严重的心肌损伤，单独吸入氢气或一氧化碳均无明显的保护作用，但联合应用氢气和一氧化碳则可以明显减轻心肌损伤，减少梗死面积，降低血清肌钙蛋白和肌酸磷酸激酶(CPK)水平。研究表明，联合应用氢气和一氧化碳可通过抗氧化和抗炎双重机制明显增强抗心肌损伤能力，可能成为临床预防缺血再灌注损伤的一种有效方法。

Fukuda等通过阻断肝左叶和左中叶的血供90分钟、再灌注180分钟建立了部分肝缺血再灌注损伤模型，导致肝细胞广泛变性，胞质空泡化，在缺血期的最后10分钟开始吸入氢气(1%～4%)190分钟可以明显减轻肝细胞的变性坏死，减少肝脏谷丙转氨酶(ALT)的释放，显著降低血清MDA水平，显示了氢气在肝缺血再灌注损伤中具有显著的保护作用。

小肠缺血再灌注损伤可在许多临床情况下发生，如肠系膜动脉阻塞、低血容量性休克、小肠移植等。缺血的小肠是许多促炎介质的主要来源，这些_促炎介质不仅会引起局部的小肠损伤和功能障碍，而且会引起全身炎症反应，导致多器官衰竭。Zheng等的研究表明，大鼠小肠缺血再灌注前10分钟静脉注射氢气饱和生理盐水(5mL/kg)，能显著降低血清二胺氧化酶(DAO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)及组织MDA、髓过氧化物酶(MPO)水平，减轻小肠黏膜糜烂，肠壁渗透性增加等损伤。该小组进一步研究表明，静脉注射氢气饱和生理盐水还可以抑制大鼠肠缺血再灌注后肺组织中性粒细胞浸润，脂质过氧化，降低TNF-α、IL-1β水平，从而减轻肠缺血再灌注后的肺损伤。

Buchholz等的研究发现，大鼠小肠移植术后24小时发生胃肠传输延迟，空肠环状肌收缩性降低，炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6及组织MDA、MPO水平升高，组织病理结果显示肠黏膜糜烂、肠壁渗透性增加。

如果供体术前吸入2%的氢气1小时、受体术前1小时开始吸入2%的氢气持续至术后1小时则能显著改善上述病理改变，促进小肠移植后肠道功能的恢复。在受体的肺组织中，吸入氢气明显减少了炎性因子mRNA的上调，减少了中性粒细胞浸润，这表明氢气不仅可以明显减轻局部的小肠移植损伤，而且可以通过其抗氧化效应和抗炎效应抑制远隔器官的损伤。

短暂的眼内压升高所致的视网膜缺血再灌注损伤可以通过产生大量的ROS导致神经损伤。

Oharazawa等研究了氢气饱和生理盐水对视网膜缺血再灌注损伤的神经保护作用，他们通过给大鼠升高眼内压60分钟建立视网膜缺血模型，在缺血和再灌注过程中连续在眼睛表面滴加氢气饱和盐水。

结果显示，连续给予氢气饱和盐水后，玻璃体内氢气浓度立即升高，·OH水平明显下降。缺血再灌注后第1天，与对照组相比，视网膜凋亡细胞数目明显下降，氧化应激指标阳性细胞数也明显减少;缺血再灌注后第7天，与对照组相比，视网膜损伤情况明显减轻，视网膜厚度恢复至>70%。

上述研究结果表明，在再灌注前开始吸入1%～4%的氢气直至再灌注结束或在再灌注前开始应用氢气饱和生理盐水可以明显减轻器官的缺血再灌注损伤。

3.2　氢气与慢性异基因移植物肾病

慢性异基因移植物肾病(CAN)是移植肾晚期功能衰竭的主要原因，其特点是进行性肾功能衰竭，临床表现为肾性高血压和蛋白尿，许多因素与之有关，包括免疫因素(如急性排斥反应)和非免疫因素(如缺血再灌注损伤)，而氧化应激被认为是引起免疫应激和非免疫应激的共同途径，移植物肾病的病理特点表现为间质纤维化和肾小管萎缩。氧化应激一方面可以通过增加炎症因子的产生促进间质纤维化的形成;另一方面，通过激活炎症信号通路，介导内皮细胞向间质细胞的转换，最终导致肾小管萎缩。

Cardinal等研究了饮用含氢水对大鼠移植物肾病的治疗效果，他们将路易鼠的肾脏移植到双侧肾脏切除的挪威鼠体内，并于术后开始每天给移植鼠饮用氢水，持续150天。研究结果显示，饮用氢水可以使肾脏局部及血清中分子氢的浓度升高，15分钟时达到高峰，而长期饮用氢水并不会导致体内氢的聚积。饮用氢水可以改善移植肾的功能，与饮用普通水的大鼠相比，表现为术后60d血尿素氮水平降低、肌酐清除率升高、蛋白尿减轻;同时，移植肾受体的存活率明显升高。组织学分析显示，与普通水组相比，术后60天饮用氢水组的大鼠肾小球硬化和炎症细胞浸润明显减轻，间质纤维化情况和平滑肌细胞增生也明显改善；移植肾内MDA及过氧亚硝酸盐水平降低；定量RT-PCR结果显示，氢水组术后60d移植肾内炎症细胞因子TNF-α、IL-6、细胞内粘附分子-1(ICAM-1)及IFN-γ的水平比普通水组明显减低;Western blot结果显示，氢水组的炎症信号通路——丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的激活程度比普通水组明显减弱。

以上结果显示，饮用氢水可以通过抑制移植物肾病改善异基因移植肾的功能，提高移植肾受体的生存率，其机制一方面是通过氢气的抗氧化活性减少氧化应激介导的移植肾损伤；另一方面，通过减少炎症因子的产生抑制间质纤维化的形成，并抑制炎症信号通路的激活最终阻止移植物肾病的发展。

3.3　氢气与急性放射综合征

急性放射综合征(ARS)是指短时间内受到大剂量的电离辐射后出现的一种严重疾病，它是一种全身性反应，以造血系统和胃肠道的损伤最为明显，严重时可导致死亡。电离辐射与机体内水分子相互作用，产生多种活性自由基，是引起细胞损伤及死亡的最主要因素。大量研究表明，ROS，尤其是羟基自由基和过氧亚硝酸盐，在电离辐射损伤中起主要作用。据估计，60%～70%的电离辐射损伤是由羟基自由基引起的，及时清除电离辐射产生的羟基自由基是防治电离辐射损伤的重要靶点。迄今为止，尚无有效性、安全性、选择性及患者耐受性等方面均理想的辐射防护剂。

Liu等基于氢气可以选择性清除细胞毒性强的羟基自由基这一特征，提出了氢气可能是很有应用前景的、高效而特异的辐射防护剂的假说，值得进一步实验验证。

3.4　氢气与败血症

败血症是重症监护病房(ICU)患者最常见的死亡原因，而活性氧的过度产生在败血症的发病过程中起重要作用。Xie等通过盲肠结扎加穿孔法制备了小鼠败血症模型，结果显示，术后24h小鼠出现明显的多器官损伤，肺MPO活性、湿干重比值及支气管肺泡灌洗液蛋白含量均升高，血清生化指标及组织病理学分数也升高，而术后1h和6h开始吸入2%氢气的小鼠上述改变明显减轻，这一作用与降低氧化产物、增强抗氧化酶的活性有关。

3.5　氢气与结肠炎

葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎是人类炎症性肠病的动物模型，表现为体重下降、厌食、血便及肠道炎症的组织病理学改变。Kajiya等研究发现，连续给小鼠饮用DSS(5%)5d后，小鼠出现明显的体重下降，结肠炎评分呈时间依赖性增长，结肠长度病理性缩短，结肠损伤部位的IL-12、TNF-α及IL-1β均升高;而在DSS溶液中添加氢气(氢气达到饱和浓度)可使上述损伤明显改善。组织学分析结果显示，炎症细胞浸润减少、上皮细胞结构破坏减轻，这表明氢气可通过下调促炎因子的表达和抑制炎症细胞的浸润减轻DSS诱导的结肠炎。

3.6　氢气与顺铂治疗

顺铂(cisplatin)是目前临床最常用的抗肿瘤化疗药物之一，但该药呈剂量依赖性的急性肾毒性，大大限制了其临床应用，长期用药可导致患者出现急性肾功能衰竭及严重代谢紊乱等后果。目前对于顺铂引起肾毒性累积的机制尚不是十分清楚，有研究表明，氧化损伤可能是其主要原因。顺铂进入机体后可生成大量·OH和活性氧自由基，破坏细胞氧化-还原的平衡状态，引发氧化应激，通过细胞膜脂质的过氧化反应、蛋白失活和DNA变性引发细胞损伤和坏死。

Nakashima-Kamimura等通过给C57BL/6CrSlc小鼠腹腔注射顺铂(17mg/kg)建立顺铂化疗模型，研究结果显示，吸入1%氢气能明显降低小鼠死亡率，改善体重下降，降低血肌酐和尿素氮水平及MDA水平;组织病理学结果显示，吸入氢气可以明显改善肾小管上皮细胞胞浆空泡变性、管腔扩张、肾小管上皮细胞坏死等变化。研究还发现，给小鼠饮用含氢气水(0.8mmol/L)也可以达到与吸入氢气同样的效果。有意义的是，氢气治疗在减轻顺铂肾毒性的同时，并不影响顺铂对体外癌细胞及荷瘤小鼠体内癌细胞的抗肿瘤活性，因此，氢气在抗肿瘤治疗中也具有潜在应用价值。

综上所述，氢气是一种理想的抗氧化剂。氧化应激损伤涉及机体许多器官系统的多种疾病的发病过程，外源性氢气通过选择性清除细胞毒性极强的·OH，能对多种疾病和病理过程的氧化应激损伤起到有效的保护作用，而且无明显毒副效应，加之氢气易于制备，使用时方便、安全，在临床医疗中有广阔的应用前景，值得高度关注，但仍需积累更多的实验资料和临床验证。此外，氢气虽然是惰性气体分子，但除了清除·OH外，是否还具有其他未知生物学效应，以及机体自身产生的肠源性氢气的生理和病理生理意义均需进一步深入研究。